​2019年2月13日，Drug Discovery Today：Technologies发表了Craig Crews针对PROTAC技术的最新综述文章。PROTAC的前世今生其实已有综述总结（【PROTAC】新药开发系列（十）2019最新综述）。该文有趣之处在未来和展望，客观地呈现了PROTAC的优势与不足。一背景 过去十年，药物靶标领域的格局发生了重大变化。重点已经从传统药物靶标，如G蛋白偶联受体（GPCR），离子通道和激酶转向更具挑战性的“不可成药”靶标。尽管从生物学角度来看传统靶标仍然具有吸引力。这些靶标通常包括无酶功能的蛋白质，如转录因子和支架蛋白。历史上，那些具有明确活性位点，且适合结合小分子的药物靶标，一直是药物干预的重点。因此，针对这些明确活性位点的靶标开发传统小分子抑制剂时现代药物开发的常规方法。所以，目前大多数药物都是小分子抑制剂，主要通过占据驱动的药理学作用模式（MOA）来控制蛋白功能（图1a）。尽管该方法已经成功，但这种MOA不能应用于所有生物靶标，尤其是那些缺乏酶活性的靶标，如支架蛋白或通过蛋白-蛋白相互作用（PPIs）发挥作用的蛋白质。通过药物占用驱动的MOA控制蛋白功能是通过保持高靶标占用率来实现的，而高浓度药物产生的脱靶效应将会导致患者的不良反应。此外，抑制/占据驱动疗法的耐药性已经在许多疾病中被观察到，例如癌症和细菌感染。因此，我们需要努力开发新作用机制的药物，以调节非传统药物靶标和防止耐药性。新作用机制包括，如核酸疗法，修饰的多肽，重组蛋白和单克隆抗体。 图1 占据驱动和事件驱动的药理学区别 PROteolysisTArgeting嵌合体（PROTACs）分子是一种利用事件驱动的MOA，更是非常有前景的新药开发模式。PROTAC可以通过诱导目标蛋白的降解来调节蛋白水平（图1b）。作为异双功能分子，它由结合目标蛋白（POI）的配体、Linker和E3泛素连接酶（E3）配体组成（图1c）。PROTAC通过与POI和E3形成三元复合物来启动该POI的降解。先是使POI被泛素化标记，然后通过26S蛋白酶体识别并降解多泛素化的POI（图1b）。26S蛋白酶体是泛素-蛋白酶体系统（UPS）的一部分，它是真核细胞调节蛋白质水平的主要机制。在本综述中，所有符合上述定义的化合物将被称为PROTAC。当然，文献中也使用其它名称：如，特异性和非遗传性IAP依赖性蛋白质橡皮擦（SNIPER）、降解剂、degronimids、PROteolysis TArgeting Peptide（PROTAP）、蛋白质降解探针（PDP）。 本综述介绍了PROTAC技术发展过程中的里程及现状，特别关注了2018年年的关键发现，并指明了利用蛋白降解机制开发治疗性新药未来的发展方向。 二前世 图2展示了PROTAC各阶段发展的里程碑及使用PROTAC技术成功降解的目标蛋白。2001年Crews和Deshaies实验室报告了第一个PROTAC，是利用了含SCFβ-TRCP的E3诱导MetAp-2的降解。接下来的PROTACs分子诱导了AR和ER的降解，从而扩大了可降解目标蛋白的范围。这些PROTACs分子通过显微注射进入细胞，结果显示它们可以在细胞中靶向降解AR和ER。随后的PROTAC则是使用HIF-1α肽片段携带细胞穿透肽序列，以在细胞中利用含VHL的E3降解目标蛋白，无需显微注射（见图1c）。然后，研究者将较短的HIF-1α肽片段作为PROTAC的E3连接端，靶向降解了芳烃受体核转位蛋白（ARNT）。虽然第一代的PROTAC可以诱导目标蛋白的特定降解，但它们仅有低微摩尔的活性。此外，由于它们含肽，故细胞渗透性较差，细胞活性低，这大大限制了PROTAC技术在新药开发中的应用。 图2 PROTAC技术开发的重要里程碑 PROTAC技术的一项显著进步是发现了特异性结合E3泛素连接酶的小分子。基于小分子的PROTAC在2008年被首次报道。该PROTAC（图1c）利用含MDM2的E3诱导AR的降解，其E3结合配体是MDM2-p53的PPI抑制剂nutlin。该研究证明了透膜PROTAC的开发是可行的，但诱导AR降解的浓度较高（微摩尔级别）。与此同时，研究者发现cIAP1结合bestatin methyl esters可促进其自身泛素化和降解。Hashimoto课题组使用这些bestatins设计了第一个PROTAC，利用cIAP1靶向降解CRABP-I和II。2012年，VHL的高亲和力拟肽配体被发现。随后，Ciulli课题组报道了结合VHL拟肽配体的构效关系研究。同时，Cereblon（CRBN）被鉴定为免疫调节药物（IMiDs）沙利度胺、泊马度胺和来那度胺的结合靶标。在与CRBN结合后，观察到IMiDs促进目标蛋白，如Ikaros、Aiolos和CK1α的降解。 那时候，还没有发现在体内也具有降解目标蛋白作用的PROTAC分子。直到2013年，研究者设计了第一种在体内可降解目标蛋白的PhosphoPROTACs分子，它们能够抑制小鼠身上人源肿瘤的生长。此外，通过利用受体酪氨酸激酶（RTK）信号通路的天然特异性，PhosphoPROTACs能够区分不同的RTK信号传导途径。通过接上与目标激酶相结合的磷酸化肽而获得降解不同激酶的选择性。 与VHL结合的小分子配体首先用在了HaloPROTACs上。这些HaloPROTACs由与VHL结合的小分子配体和与HaloTag7（HT7）共价连接的氯代烷烃组成。HT7是一种经修饰的细菌脱卤素酶，与氯代烷烃共价结合。HaloPROTACs成功地利用含VHL的E3以诱导异位表达的绿色荧光蛋白（GFP）-HT7融合蛋白的降解。最有效的HaloPROTAC降解GFP-HT7的最大降效率（Dmax）达到90％，显示出低纳摩尔的降解效果，DC50=19nM。 使用基于小分子配体的PROTAC化合物具有更多类似药物的特性，使其可以高效的透过细胞膜。2015年，Crews课题组与GSK合作，开发了一种降解丝氨酸/苏氨酸-蛋白激酶的靶向PROTAC（见图1C）。该PROTAC一头是结合VHL的小分子配体，另一头则是RIPK2抑制剂，可以选择性地诱导RIPK2降解，且具有低纳摩尔细胞活性（DC50 =1.4nM）。此外，利用体外蛋白泛素化试验证明了PROTAC的催化性质。将其立体异构体，且无法结合VHL的PROTAC分子作为阴性对照，该分子不能降低RIPK2水平，证明了PROTAC是通过利用含VHL的E3连接酶降解RIPK2蛋白的。同时，研究者还报道了使用结合CRBN或VHL的小分子配体靶向BRD/ BET表观遗传蛋白家族的PROTAC（见图1c）。 另一类型的PROTAC是由Astex制药公司开发的In-cell CLIck PROTAC（CLIPTAC）。CLIPTAC是通过生物相容性反应（例如Diels - Alder反应）在细胞内形成PROTAC。依次用细胞可渗透的四嗪取代的沙利度胺衍生物和反式环辛烯取代的目标蛋白配体处理细胞，可形成新的PROTAC降解目标蛋白（BRD4和细胞外信号调节激酶ERK1 / 2）。 总而言之，PROTAC技术将对药物发现产生重大影响。 三今生 1、已被降解的目标蛋白 迄今为止，研究最多的可被PROTAC降解的目标蛋白是BET和激酶家族，后者包括跨膜RTK和最近的脂质激酶、PI3K。除了这些蛋白质家族外，最近的例子包括Sirt2、HDACs、PCAF和GCN5。在过去的一年里，已经开发出homo - PROTAC用于靶向降解VHL和CRBN。尽管最近开发的大多数PROTAC都使用基于结合E3的小分子，但有一些例子则是使用HIF-1α肽作为与E3结合的部分，用于靶向降解目标蛋白，如：Smad3，Akt，Tau，和Bcl-xL。图2的方框中显示了利用PROTAC技术降解的目标蛋白。 2、降解机制的思考 为了解PROTAC的降解机制，科学家们已经做了大量的研究工作。三元复合物（POI - PROTAC - E3）的形成被科学家们认为是PROTAC降解蛋白的关键（图3）。 图3 PROTAC降解目标蛋白源自形成稳定的三元复合物 PROTAC诱导目标蛋白降解的机制取决于三元化合物的形成，其能使目标蛋白泛素化，然后被蛋白酶体降解，如前所述（图1b）。目前，已经建立了描述三元复合物形成的数学模型，它们可以应用于PROTAC降解目标蛋白机制的解释。这些模型预测了活性对PROTAC浓度的钟形依赖关系（图3a）。例如，在高PROTAC浓度下，可以观察到非降解性二元复合物的产生，这种现象被称为陷阱效应（图3a）。此外，目标蛋白和E3之间的吸引或排斥作用可能影响三元复合物的形成（图3b）。我们用术语——协同性（α）来描述这些相互作用。当稳定目标蛋白和E3之间的PPI促进三元复合物形成时，发生正协同性（α> 1）。相反 ，当相互作用是消除三元复合物形成时，发生负协同作用（α< 1）。已经证明正协同性可以最小化陷阱效应的程度，从而有助于三元复合物的形成。 Ciulli课题组在2017年报道了第一个三元复合物的晶体结构。该晶体结构是由MZ1、BRD4和VHL构成。其揭示了BRD4和VHL之间的接触，以及PROTAC与BRD4和VHL之间的相互作用。研究者利用各种生物物理方法评估了协同性作用，结果显示，稳定的三元复合物使得PROTAC的降解效率更高，且对BRD家族蛋白具有选择性降解效果。 最近的研究进一步表明，三元复合物的形成可能比目标蛋白配体或PROTAC对目标蛋白的二元亲和力更为重要。基于foretinib的PROTAC对激酶p38α（Kd = 11μM）仅具有较低的二元结合亲和力，但其仍可有效诱导目标蛋白的降解（DC50 = 210 nM，Dmax = 91％）。研究发现，PROTAC介导了在p38α和VHL之间稳定PPI的三元复合物形成，弥补了低二元亲和力的不足，从而诱导目标蛋白的降解。这一发现说明，利用高亲和力目标蛋白配体并不足以获得降解高效的PROTAC。尽管I-BET726（Kd = 4 nM）是较JQ1（Kd = 100nM）与BRD4亲和力更高的配体，但实际上，含JQ1的PROTAC在促进E3诱导的BRD4降解方面更高效，这与通过正协同作用促进三元复合物形成的能力评估结果一致。 然而，也有一些例子表明，正协同性对高效降解似乎并不太重要。如，强效降解BTK（DC50 = 1-40 nM）和BRD4（DC50 = 5-50nM）的PROTACs，两者均利用含CRBN的E3连接酶降解目标蛋白，但试验显示CRBN和目标蛋白之间只有很少甚至没有正协同作用。Gray课题组利用BRD4（BD1和BD2两个溴结构域）、CRBN和PROTAC的三元复合物的晶体结构，并结合生化和细胞数据，在分子水平上对PROTAC介导的三元复合物对降解的影响进行了研究。他们发现，BRD4能与CRBN的C或N末端形成不同的三元复合物，这是因为PROTAC中不同的Linker长度所致。 由于其催化性质，PROTAC被称为泛素连接酶的“可编程基本激活剂”。可编程，指的是PROTAC可以设计为降解任何目标蛋白。基本，则是指必不可少的，因为没有催化反应，即泛素标记，将不会发生蛋白降解。而，激活剂，即活化剂，因为它们以催化方式介导三元复合物的形成。因此，将PROTAC视为激活剂可以为设计更强大的PROTAC奠定基础。 [...]